本文標(biāo)題："顯微鏡帶有自動照像設(shè)備-圖像型科研儀器"
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顯微鏡帶有自動照像設(shè)備-圖像型科研儀器
在觀察過程中熒光會有所減弱，當(dāng)然如果將材料浸人抗減退
試課劑，如Vectashield，可以大大減少這種熒光的減弱。因此盡
快地拍攝記錄下圖像是十分重要的。由于用于激發(fā)DAPI的高能量的
短波長光，例如近UV／紫色，要比用于顯示德克薩斯紅和羅丹明的
較低能量的長波長光更快地使熒光染料漂白，因此建議首先拍攝紅
色熒光信號然后再拍攝綠色熒光，最后是藍(lán)色熒光圖像。拍攝ISH
熒光可能比較困難，因?yàn)橥ǔ晒庑盘杻H占圖像框的一小部分，并
且背景黑暗。如果顯微鏡帶有自動照像設(shè)備，它是根據(jù)整個拍攝視
野的光來計(jì)算曝光的，取的是熒光和周圍黑暗區(qū)域的平均值。因此
會使照片曝光過度。使用點(diǎn)測量設(shè)備或者在照相機(jī)上的暗視野設(shè)置
，或是手動控制曝光時間，這個問題即可迎刃而解。還有一種辦法
，即在預(yù)期曝光設(shè)置以下至少選兩個設(shè)置曝光。對于明亮的ISH信
號，其曝光時間大概在10-30s左右。對于較弱的信號，例如低拷貝
探針的信號，可能曝光時間要達(dá)到5min。DAPI圖像通常比ISH信號
亮得多，則僅要曝光數(shù)秒即可。·
·陽性對照 陽性對照是用來證明所使用的變性、雜交及檢測
試劑均反應(yīng)正常。
如果陽性對照反應(yīng)正常而試驗(yàn)的載玻片卻失敗，就表明試驗(yàn)用
的探針有問題，
并非是ISH反應(yīng)本身的問題。陽性對照包括那些靶序列已知在
試驗(yàn)材料中以
多拷貝存在的探針，如核糖體DNA探針。
·陰性對照
——用來確定非特異性標(biāo)記的程度。不使用任何探針或者用一
個在試驗(yàn)材料中
不存在的不相干的探針，或者用未標(biāo)記的目的DNA序列進(jìn)行實(shí)
驗(yàn)
——用來確定探針雜交的特異性。在不同的嚴(yán)緊性條件下進(jìn)行
實(shí)驗(yàn)。
隨著嚴(yán)緊性的增加，雜交位點(diǎn)的數(shù)量會減少。在較高的嚴(yán)緊性
條件下，留下
的只有那些與目的序列相對應(yīng)的特異的雜交位點(diǎn)疑難解答
由于ISH的時間較長，步驟較多，不可避免地會產(chǎn)生很多問題
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